高效液相色谱分析(高效液相色谱基本原理)原创丁当学术2020-01-19 20:37:34
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高效液相色谱是色谱的一个重要分支，具有广泛的应用和对样品的广泛适用性 。它不受分析对象的挥发性和热稳定性的限制 。几乎所有的化合物，包括高沸点化合物、极性化合物、离子化合物和大分子物质，都可以用高效液相色谱法进行分析测定，从而弥补了气相色谱法的不足 。在已知的有机化合物中，大约20%可以通过气相色谱进行分析，而80%需要通过高效液相色谱进行分析 。高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度好的特点，能够分析和分离沸点高、不能气化的热不稳定生理活性物质 。它已成为分离分析技术在化学、医学、工业、农业、商品检验和法律检验等领域的重要应用 。
一
基本原理色谱的分离原理是:当溶解在流动相中的各组分通过固定相时，由于与固定相相互作用(吸附、分布、排斥和亲和)的大小和强度不同，以及在固定相中的保留时间不同，各组分相继从固定相中流出 。也称为色谱法和色谱法 。
高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上，以液体为流动相，采用高压输液系统 。将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂和缓冲液等流动相泵入具有极细颗粒的高效固定相的色谱柱中 。柱内成分分离后，进入检测器进行检测，从而实现样品的分析 。
图1 。高效液相色谱分析流程
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系统组成高效液相色谱系统一般由输液泵、注射器、色谱柱、检测器、数据记录和处理装置等组成 。输液泵、色谱柱和检测器是关键部件 。此外，梯度洗脱装置、在线脱气器、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等 。也可以根据需要进行配置 。现代高效液相色谱仪还具有微机控制系统，用于仪器自动控制和数据处理 。制备型高效液相色谱仪还配有自动馏分收集装置 。
图2 。高效液相色谱仪的系统组成
1.输液系统输液泵是高效液相色谱系统中最重要的部件之一 。输液泵根据输出液体恒定的因素分为恒压泵和恒流泵 。泵的性能直接影响整个系统的质量和分析结果的可靠性 。
输液泵根据工作方式可分为气动泵和机械泵 。机械上有螺杆驱动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复隔膜泵 。
表1 。几种高压性能泵的性能比较
高效液相色谱使用的输液泵应满足以下条件:
①流速稳定，其RSD应小于0.5%，这对定性定量分析的准确性非常重要；
②流量范围宽，分析型应在0.1 ~ 10毫升/分钟范围内连续可调，配制型应达到100毫升/分钟；；③输出压力高，一般应达到150 ~ 300kg/cm2；
④液压缸体积小；
⑤密封性能好，耐腐蚀 。
(1)往复柱塞泵
当活塞向外运动时，泵头出口止回阀关闭，流动相入口止回阀打开，溶液(流动相)被泵入活塞缸 。当柱塞被推入气缸时，入口止回阀关闭，出口止回阀打开，流动相被压出活塞气缸，流向色谱柱 。双活塞往复泵的输液流量远小于单活塞泵 。其优点是不需要使用阻尼器来消除脉冲，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节比单活塞泵复杂 。往复柱塞泵的特点是连续供给恒定体积的流动相，不受整个色谱系统其他部分阻力微小变化的影响 。
图3 。单活塞往复柱塞泵的结构(a)和双活塞往复柱塞泵的结构(a)和排液特性(b)
(2)隔膜往复泵
隔膜往复泵也是一种恒流量泵 。当活塞与油接触时，隔膜受油压作用，吸引或推动流动相部分，使流动相部分的单向阀吸收或排出液体，从而获得稳定的液体流动 。隔膜泵的活塞不与流体直接接触，因此不存在活塞垫片磨损对流动相的污染 。隔膜泵死体积小(约0.1mL)，因此更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱 。然而，隔膜泵结构复杂且昂贵 。
4.隔膜往复泵结构示意图
(3)气动增压泵
气动增压泵是一种恒压泵 。泵头通常由两部分组成——止回阀和密封圈——柱塞杆 。通常，单向阀由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成 。在压力的作用下，红宝石球离开阀座，流动相流经单向阀 。相反，在反作用力的作用下，宝石球回到阀座，流动相不再流过止回阀 。
2.脱气装置由于溶解氧或与空气体混合，流动相溶液经常形成气泡 。当气泡进入检测器时，色谱图上会出现尖锐的噪声峰 。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，进入流路或色谱柱的大气泡会使流动相流速变慢或使流速不稳定，导致基线波动 。气泡一旦进入色谱柱，需要很长时间才能排出 。在荧光检测中，溶解氧也可以淬灭荧光 。溶解的气体也可能导致一些样品氧化或改变溶液的酸碱度 。
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